2023年6月20日，北京大学高宁教授课题组在Cell Discovery上发表了题为“Structural and mechanistic insights into the DNA glycosylase AAG-mediated base excision in nucleosome”的研究论文。论文利用冷冻电镜技术阐明了DNA糖基化酶（DNA glycosylase）在核小体（Nucleosome core particle，NCP）不同位置上的碱基切除机制。

真核生物的碱基切除修复（Base excision repair，BER）可以定位和修复染色质中的DNA损伤。基因组DNA中含有大量外源损伤剂诱导和自发分解反应造成的DNA碱基损伤。DNA糖基化酶可以识别并切除损伤的DNA碱基，生成一个无嘌呤/无嘧啶的位点（AP site），这个位点可以被核酸内切酶APE1切割并在DNA上产生一个缺口。随后的修复过程可以通过DNA聚合酶、DNA连接酶以及相关蛋白质因子通过两种途径修复（Short-patch and long-patch BER pathways）。

烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG (3-methyladenine DNA glycosylase)可以识别包括3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），7-甲基鸟嘌呤（7-methylguanine，m⁷G），氧化腺嘌呤1,N⁶-乙醇腺嘌呤（1,N⁶-ethenoadenine, εA）和脱氨腺嘌呤次黄嘌呤（Hypoxanthine）在内的碱基损伤。在人类中，AAG的表达改变与微卫星不稳定性、自发移码突变和多种癌症有关。在小鼠模型中，AAG敲除小鼠容易发生肝癌和结肠直肠癌，而在AAG过表达的小鼠中，过度的AAG活性会导致肝毒性、致死和其他烷基化诱导毒性。

DNA的碱基损伤可以发生在染色质化的真核生物基因组的所有区域，包括核小体DNA位点。核小体作为天然的屏障会阻碍BER相关蛋白对损伤位点的接触，只有一部分面向溶剂侧的DNA自由暴露。广泛的体外研究表明，BER因子可以选择性地定位并结合到核小体中的不同损伤位点。一般来说，AAG在某一位点的活性和该位点的可接触性正相关，研究证实与组蛋白核心区域相互接触的DNA具有更高的突变率，这可能由于BER因子与损伤碱基低的接触性密不可分。在结构上，损伤碱基的可接触性取决于其在核小体上的平移位置和旋转方向，面对溶剂的损伤碱基确实比封闭和嵌入的损伤碱基更容易被修复。以往的结构研究主要聚焦在DNA糖基化酶对于裸露DNA上的修复机制，但这些蛋白质如何克服核小体施加的障碍来定位和修复核小体中的DNA碱基损伤尚不完全清楚。本研究将模拟损伤的碱基（Deoxyinosine, DI）设计在核小体DNA的不同位置上，包括不同的超螺旋（Superhelical locations, SHLs）和旋转方向上（图1a），这些位置分别代表了不同的SHLs上相似性的位置（-30，-50）和同一个SHL上不同旋转方向上导致的溶剂可及性不同的位置，包括完全暴露（-50），封闭（-53）和嵌入（-55）的位置上。通过冷冻电镜技术分别解析了四种包含损伤碱基的核小体结构（Apo-state）以及核小体和DNA糖基化酶AAG的复合物结构（Post-catalytic state）。

图1 AAG-NCP^-30AP复合物示意图

结构分析表明在线性或者核小体DNA底物上，AAG都使用一组同样的保守氨基酸残基进行相互作用，并且作用模式比较相似（图1b-g）。重要的是，通过与不包含DI的NCP结构比较，作者发现仅存在一个DI核苷酸就足以全面扰动核小体DNA的结构，导致核小体DNA和组蛋白核心之间的包埋表面积减少，并且无论受损碱基的位置如何，这些核小体DNA的整体扰动都处于相似的模式：由DI引起的DNA形变在核小体DNA出口附近最为明显。

进一步的结构分析发现，在形成的稳定AAG-NCP复合物中（包括-30，-50，-53），NCP的损伤位点都已变成了AP site，处于催化后状态（post-catalytic state）。在这些AAG-NCP^AP复合物中，AAG的结合导致受损碱基周围的核小体DNA发生非常显著但相对局部的扭曲，根据受损部位的平移和旋转位置，AAG利用不同的机制接触损伤的碱基。（1）对于具有高溶剂可及性的完全暴露的DNA损伤碱基，AAG具有很高活性，能直接接触这些损伤碱基，在结构上直接增加DNA的局部扭曲以识别损伤位点（图2a）。（2）对于具有中等溶剂可及性的封闭的DNA损伤碱基，AAG的活性相比于完全暴露位置的AAG活性低，AAG诱发剧烈的局部的DNA扭曲，并且为了接触到修复碱基，还需要DNA的旋转和包含约1 bp的位移去缓解核小体的造成空间障碍（图2b）。（3）对于溶剂可及性极低的深埋位置的DNA损伤碱基，局部DNA扭曲和有限的核小体DNA位移不足以完全暴露埋藏的碱基。此时，被DI整体扰动的核小体可能更容易自发展开（nucleosome breathing），AAG可以利用这一特性来捕获分离的末端dsDNA并使这一过程不轻易可逆。因此，在这些完全深埋的位点中，核小体DNA的部分开放可能是AAG的招募和催化的先决条件（图2c）。

图2 AAG介导的核小体碱基切除的示意图

综上所述，本研究解析了包含不同位置损伤的核小体结构以及核小体和DNA糖基化酶AAG的结构，揭示了碱基损伤对核小体稳定性的影响，为理解DNA糖基化酶AAG如何利用核小体的结构动力学参与核小体中的DNA碱基损伤修复提供了一个机制框架。在更广泛的背景下，这些数据也有助于理解其它的DNA结合蛋白如何调控核小体的结构动力学来发挥其分子功能。

金沙集团wwW3354CC高宁教授为本文的通讯作者。高宁实验室的郑吕钦（已毕业）和蔡斌（已毕业）为本文的共同第一作者。金沙集团wwW3354CC的李晴教授提供了本实验所需的爪蟾组蛋白的质粒。本研究得到了国家重点研发计划、生命联合中心、膜生物学国家重点实验室和金沙集团wwW3354CC启东产业创新基金的经费支持，以及冷冻电镜平台、北京大学电镜实验室、高性能计算中心、生科院仪器中心及凤凰工程的技术支持。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41421-023-00560-0